سلولی

روش انجام آزمایش MTT

بررسی میزان بقا و تکثیر سلولی

تکنینک MTT برای بررسی عدم سمیت دارو ها و ترکیبات جدید، بررسی زنده مانی، بقا و تکثیر سلولی استفاده می شود. در مطالعات بررسی سمیت مانند بررسی فعالیت ضد توموری، عصاره های طبیعی یا ترکیبات جداسازی شده و مولکول های بزرگ مورد بررسی قرار می گیرند. برای این منظور سلول های زنده، مرده و مهار شده بررسی می شوند.

روش های متعددی برای تعیین تعداد سلول و زنده مانی یا بقا سلولی (viability) آن ها شامل H- تیمیدین، شمارش سلولی با تریپان بلو، سنجش های فلوریمتریک DNA، یا تکنیک فلوسایتومتری وجود دارد. بیشتر این روش ها مشکلاتی مثل تولید مواد سمی یا رادیو اکتیو دارند و یا کار با آن ها زمان بر و گران قیمت است. تعداد سلول های زنده و فعالیت متابولیکی می تواند با اندازه گیری محتوای NADH و NADPH تعیین شود، چرا که نوکلئوتیدهای پیریدین در طی فعالیت متابولیکی تشکیل می شوند. اندازه گیری مستقیم این عوامل احیا شونده امکان پذیر است، اما سطح مطلق این ترکیبات، شاخص بهینه ای برای فعالیت متابولیکی سلول نیست چرا که میزان احیا آن ها عامل مهمتری می باشد.

میزان احیای این ترکیبات، می تواند با احیای ترکیباتی مثل نمک های تترازیلیوم مختلف (شامل MTT، MTS، XTT یا (WST) یا resazurin ارزیابی شود، چرا که در فرآیند احیای آنزیمی این ترکیبات توسط دهیدروژنازها، NADPH/NADH به عنوان کو-سوبسترا استفاده می شود.

تکنینک MTT
تکنینک MTT

مطالب مرتبط: چرخه سلولی و سایکلین هارده های سلولی در آزمایشگاه کشت سلول

شکل احیا شده این ترکیبات منجر به تشکیل یک ترکیب رنگی می شود که می تواند توسط روش های اسپکتروسکوپی اندازه گیری شود. از آنجا که فعالیت متابولیکی سلول در حین کشت حفظ می شود، تعداد سلول های زنده متناسب با غلظت محصول رنگی است.

در تست MTT، یک محصول کریستالی به نام فورمازان شکل می گیرد، که یکپارچگی سلول را از بین برده و در نهایت منجر به مرگ سلول می شود. با شکل گیری کریستال های سوزنی شکل فورمازان سلول تخریب و مرگ سلولی رخ می دهد، در نتیجه شکل گیری کریستال های فورمازان متوقف و متابولیسم پایان می پذیرد و واکنش تبدیل MTT به فورمازان به سرعت قطع شده و نقطه پایانی واکنش، برای بررسی زنده مانی و بقا سلول ارزیابی می شود.

کریستال های فورمازان زیر میکروسکوپ
کریستال های فورمازان زیر میکروسکوپ

معایب تکنینک MTT در بررسی بقا و زنده مانی سلولی

از معایب این روش، مرگ غیر قابل اجتناب سلول ها و وجود یک مرحله اضافی برای حل کردن فورمازان است که برای اندازه گیری جذب فورمازان ضروری می باشد. محلول های نمک تترازولیوم بدون رنگ یا کم رنگ هستند که وقتی محصول فورمازان را شکل می دهند، به محلولی با رنگ قوی تغییر می کنند.

در کشت سلول، اولین و معمول ترین نمک تترازولیوم استفاده شده (۴,۵-dimethylthiazol-2-yl ) می باشد که توسط T.Mosmann معرفی شد تا تکثیر سلولی و یا سمیت ماده مورد بررسی بر سلول ها را به روشی پر بازده در پلیت های ۹۶ خانه اندازه گیری کند.

مطلب پیشنهادی: عوامل تاثیر گذار بر سلول‌های کشت داده شدهچرخه سلولی و سایکلین ها

MTT، به دلیل گروه های جانبی لیپوفیلیک و بار خالص مثبت قادر است از غشای سلول های زنده عبور کند و توسط آنزیم های میتوکندریایی یا پلاسمای سلولی مثل اکسیدوردوکتاز، دهیدروژناز، اکسیداز و پراکسیداز با استفاده از NADH و NADPH، سوکسینات یا پیروات به عنوان گیرنده الکترون احیا شود، این مسئله منجر به تبدیل MTT به فورمازان نامحلول در آب می شود. علاوه بر واکنش های آنزیمی، واکنش های غیر آنزیمی مختلفی با مولکول های احیا شونده مثل آسکوربیک اسید، گلوتاتیون یا کو آنزیم A وجود دارد که می توانند با MTT بر هم کنش دهند و محصول فورمازان را شکل دهند و جذب بالاتری را به وجود آوردند.

احیای MTT به فورمازان
احیای MTT به فورمازان

به دلیل اینکه کریستال ها به صورت درون سلولی شکل می گیرند، پروتکول های سنجش بر پایه MTT، معمولا شامل یک مرحله لیز سلولی و یک مرحله حل شدن فورمازان است که قبل از اندازه گیری اسپکتروسکوپی انجام می گیرد.

علی رغم سریع و ساده بودن این روش، شکل گیری یک محصول غیر قابل حل و ضرورت حل شدن آن، این سنجش را از لیست سنجش های سریع (real-time) حذف می کند.

به همین دلیل، اصلاحاتی برای سنجش های بر پایه مطالعات Mosmann مثل روش های MTS، XTT و WST پیشنهاد شده است که عملکرد و حساسیت این سنجش را بهبود می دهد.

مطالب مرتبط: آنتی بادی ها در تست های آزمایشگاهی – کشت سلولی و اجزای محیط کشت – مراحل چرخه‌ سلولی و تفکیک سلول ها
خدمات مرتبط:خدمات سلولی – محیط های کشت تمایزی – انجام خدمت فلوسایتومتری با بانکی غنی از انواع آنتی بادی

نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

3 × یک =

همچنین ببینید
بستن
دکمه بازگشت به بالا