روش جداسازی سلول های بنیادی مزانشیمی از بافت جفت
نحوه جداسازی سلول های بنیادی از جفت
سلول های بنیادی مزانشیمی یا mesenchymal stem cell (MSC) در بافت های مختلفی از جمله بافت عضلانی، پوست، بخش ترابکولار استخوان، بافت های چربی، پری استوم، خون بند ناف و غشای سینوویال یافت می شوند. همچنین این سلول ها در بافت های جنینی شامل آمنیون، ژل وارتون، بند ناف و جفت به مقدار زیادی وجود دارند.
برای اطلاع از لیست آنتی بادی های تائید ماهیت سلول های مزانشیمی نظیر CD73,CD105,CD90 و… اینجا کلیک کنید
امروزه با روش های مختلفی می توان جداسازی سلول های مزانشیمی را از بافت ها انجام داد. به ویژه اینکه بافت های مرتبط با جنین پس از زایمان نوزاد دور ریخته می شوند و استفاده از آن ها برای مادر و نوزاد هیچ گونه خطری به همراه ندارد. استفاده از این بافت ها جهت جداسازی سلول های مزانشیمی، بسیار مقرون به صرفه خواهد بود. به علاوه، ظرفیت تکثیر و تمایز این سلول ها، به دلیل منشا جنینی آن ها، بیشتر است، لذا اخیراً توجه به این منابع و جداسازی سلول از آن ها بسیار زیاد شده است.
مطالب مرتبط: سلول های بنیادی مزانشیمی – مراحل چرخه سلولی و تفکیک سلول ها
روش کار جداسازی سلول های بنیادی مزانشیمی از بافت جفت
برای جداسازی سلول های بنیادی مزانشیمی از بافت جفت، ابتدا بافت جفت در شرایط کاملاً استریل در اتاق عمل و پس از زایمان جمع آوری می شود. سپس بافت دسیدوا (Decidua) از آن جدا شده و پس از شستشوی مکرر در بافر نمکی فسفات (PBS)، به محیط انتقالی که شامل PBS به همراه ۱ واحد در میلی لیتر پنی سیلین و ۱ میلی گرم در میلی لیتر استرپتومایسین است، منتقل می شود. برای جداسازی سلول ابتدا در زیر هود لامینار و در یک پلیت ۱۰ میلی متری، کلیه عروق و لخته های خون به روش مکانیکی از بافت جفت جدا شده و به قطعات کوچک تقسیم می شود.
جداسازی سلول های بنیادی
دراین مرحله سلول ها در محلول PBS و با دور ۱۲۵۰ RPM به مدت ۵ دقیقه شستشو داده می شود. پس از آن به منظور جداسازی سلول، به رسوب حاصله ۳۰ میلی لیتر از محلول کلاژناز با غلظت ۱ میلی گرم در میلی لیتر اضافه شده و در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد و CO2 با غلظت ۵ درصد به مدت ۱ ساعت انکوبه می شود.
برای جداسازی سلول های مزانشیمی، سوسپانسیون حاصله با دور RPM 1250 به مدت ۵ دقیقه سانتریفوژ شده و به رسوب سلولی، محلول تریپسین ۰/۲۵% که حاوی ۱ میلی مولار EDTA است اضافه می شود و در انکوباتور به مدت ۳۰ دقیقه انکوبه می شود.
فیلتر کردن و لیز RBC
رسوب بدست آمده از جداسازی سلول دو بار شستشو و سانتریفوژ شده و از فیلتر با منافذ ۷۰ میکرون عبور داده می شود. باید توجه داشت طی جداسازی سلول به منظور لیز RBC های باقی مانده در نمونه، ۲ میلی لیتر از محلول هایپوتون کلرید آمونیوم به نمونه افزوده و پس از ۱۰ دقیقه مجدداً شستشو داده می شود. رسوب سلولی حاصله از جداسازی سلول بافت جفت، به فلاسک T75 منتقل و در محیط Dulbecco’s Modified Eagle Medium-Low Glucose (DMEM-LG) کشت داده می شود.
جداسازی و انجماد سلول های مزانشیمی
طی جداسازی سلول های مزانشیمی به کف فلاسک متصل شده و دوکی شکل می شوند. پس از ۲۴ ساعت با تعویض محیط کشت، سلول های معلق (غیر مزانشیمی ) از محیط سلول جدا شده و سلول های مزانشیمال با اتصال به کف فلاسک، پس از چند روز تشکیل کلنی داده و تکثیر می شوند. هنگامی که بیش از ۹۰ % از سطح فلاسک توسط سلول ها پوشیده شد، جداسازی سلول از کف فلاسک با استفاده از محلول تریپسین ۰/۲۵% حاوی ۱ میلی مولار EDTA، انجام می شود و تعداد ۱۰۵×۵ سلول مجددا در فلاسک T75 جدیدی کشت داده می شوند و محیط کشت آن ها نیز ۴ روز یک بار تعویض می شود. به این ترتیب طی جداسازی سلول، پاساژهای متوالی از این سلول ها تهیه شده و نمونه ای از هر پاساژ، پس از افزودن محلول DMSO به همراه دکستران (DEX400) به نسبت ۴ به ۱، در ازت مایع فریز می گردد تا در شرایطی که نیاز به بررسی مجدد بر روی یک نمونه باشد، منبع سلولی در دسترس باشد.
جداسازی سلول های بنیادی از پرده آمنیون و بندناف
جهت جداسازی سلول از پرده آمنیون و بندناف، پس از انتقال بافت ها به اتاق کشت به صورت استریل، پرده آمنیون و بند ناف درون بشر حاوی آنتی بیوتیک ها (پنی سیلین و استرپتومایسین) جهت شست و شو قرار داده می شوند. برای جداسازی سلول ابتدا می بایست، آمنیون از کوریون جدا شود. پرده آمنیون شفاف و بدون عروق است، بند ناف و پرده آمنیون با قیچی به قطعه های ۵ میلی متر مکعب تقسیم شده و سپس قطعه ها درون پلیت چیده می شوند.
جهت اطلاع و سهولت شما کاربر گرامی برای استفاده از خدمات مطالعات حیوانی – بافت شناسی – آزمایشگاه بیوتکنولوژی – آزمایشگاه پاتولوژی – آزمایشگاه ژنتیک – اسانس گیری – جنین شناسی – میکروبیولوژی توسط لینک های مربوطه اقدام نمایید.
برای جداسازی سلول، بر روی نمونه ها ۱۰ میلی لیتر از محیط کشت DMEM ریخته شده و پلیت ها در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد و CO2 5 درصد انکوبه می شود. نمونه های مورد استفاده برای جداسازی سلول، هر روز زیر میکروسکوپ معکوس مورد بررسی قرار می گیرند. طی جداسازی سلول های مزانشیمی، روز پنجم، نیمی از محیط کشت آن ها تعویض شده و از آن به بعد هر سه روز یک بار این تعویض محیط انجام می شوند.
برای جداسازی سلول، در روز بیستم، سلول ها ۸۰ درصد از کف ظرف را پر کرده (confluency) و پس از این مرحله جهت جداسازی سلول، به فلاسک ها تریپسین زده و با استفاده از لام نئوبار و رنگ تریپان بلو شمارش و به ظرف های جدید انتقال داده می شوند.
برای اطلاع از لیست آنتی بادی های تائید ماهیت سلول های مزانشیمی نظیر CD73,CD105,CD90 و… اینجا کلیک کنید
مطالب مرتبط: آنتی بادی ها در تست های آزمایشگاهی – انواع آنتی اکسیدان ها و رادیکال های آزاد – کشت سلولی و اجزای محیط کشت – مراحل چرخه سلولی و تفکیک سلول ها
خدمات مرتبط:خدمات سلولی – محیط های کشت تمایزی – انجام خدمت فلوسایتومتری با بانکی غنی از انواع آنتی بادی
