ایجاد مدل ایسکمی مغزی در حیوانات آزمایشگاهی

مدل های تجربی ایسکمی مغزی به عنوان ایسکمی سراسری، کانونی و چند کانونی مشخص می شوند. ایسکمی سراسری زمانی اتفاق می‌افتد که جریان خون مغزی در کل یا بیشتر مغز کاهش می‌یابد، در حالی که ایسکمی کانونی با کاهش جریان خون به یک ناحیه کاملاً مشخص از مغز شناخته می شود. در ایسکمی کانونی مغزی، ممکن است مطلقاً هیچ جریان خونی در هسته مرکزی ایسکمی وجود نداشته باشد، اما معمولاً مقداری جریان وجود دارد که از طریق گردش خون جانبی به آن ناحیه می رسد.

ضرورت استفاده از مدل های حیوانی ایسکمی مغزی

با وجود پیشرفت های زیاد در علم پزشکی، متأسفانه هنوز درمان مـؤثر و اختـصاصی برای سکته مغزی گزارش نشده است. از رایج ترین درمان ها که تا به امروز به کار گرفته شده، استفاده از ترومبولیتیک ها است. این درمان به جهت اینکه تا ۳ ساعت پس از سکته می تواند موثر باشد، در اکثر بیماران که با فاصله زمانی دیرتر به مراکز درمانی مراجعه می کنند، نمی تواند کارآیی مناسب را داشته باشد. بنابراین لزوم مطالعه در این زمینه و استفاده از مدل های ایسکمی مغزی در مدل های حیوانی آزمایشگاهی می تواند نرخ مرگ و میر جهانی را به شدت کاهش دهد.

سکته یا ایسکمی مغزی دومین عامل مرگ و میر و علت اصلی ناتوانی های اکتسابی در سراسر جهان است. تقریباً ۸۰ درصد سکته‌های مغزی ماهیت ایسکمیک دارند و ناشی از انسداد ترومبوآمبولیک شریان اصلی مغزی یا شاخه‌های آن است. انسداد عروق منجر به محرومیت از اکسیژن و انرژی و به دنبال آن تشکیل گونه‌های فعال اکسیژن، آزادسازی گلوتامات، تجمع کلسیم داخل سلولی و القای فرآیندهای التهابی می‌شود. این توالی از رویدادها که آبشار ایسکمیک نامیده می شود، که منجر به آسیب غیرقابل برگشت بافتی (انفارکتوس) می شود.

به‌ دنبال ایسکمی مغزی اختلال در گردش خون مغز ایجاد شده و موجب بروز علائمی مثل فلج نیمه بدن، اختلال تکلم و اختلال در راه رفتن می‌شود.

آموزش ویدئویی ایجاد مدل ایسکمی

مدل های ایسکمی کانونی مغزی

اکثر مدل های ایسکمی مغزی کانونی شامل انسداد یک رگ خونی مغزی اصلی مانند شریان مغزی میانی MCA در حیوانات کوچک یا بزرگ است. انسداد MCA منجر به کاهش جریان خون مغزی در جسم مخطط و قشر مغز می شود، اما درجه و توزیع کاهش جریان خون به مدت زمان انسداد شریان مغزی میانی MCAO، محل انسداد و مقدار جریان خون جانبی بستگی دارد.

انواع مختلفی از مدل‌های MCAO وجود دارد، و در بیشتر موارد آنها انسداد دائمی یا موقت (ریپرفیوژن) با انسداد MCA در قسمت پروگزیمال یا دیستال رگ هستند. این مدل های MCAO برای شبه سازی سکته ترومبوآمبولیک انسانی به طور گسترده مورد استفاده قرار گرفته اند.

هدف از مدل های ایسکمی مغزی (کانونی و عمومی) کاهش رسیدن اکسیژن و گلوکز به بافت مغز است. این فرآیند از طریق انواع مکانیسم های سلولی و مولکولی منجر به ایجاد آسیب مغزی می شود و به دنبال آن انرژی مورد نیاز برای حفظ گرادیان های یونی مختل می گردد. مکانیسم های موجود در این مسیر شامل مجموعه ای پیچیده از رویدادهای پاتوفیزیولوژیک است که به شدت، مدت و محل ایسکمی در مغز بستگی دارد.

یک نمای کلی ساده از این مکانیسم های پاتوفیزیولوژیکی، شکست انرژی منجر به دپلاریزاسیون نورون ها می شود که باعث فعال شدن گیرنده های گلوتامات می شود که به نوبه خود شیب یونی Na+، Ca++، Cl- و K+ را تغییر می دهد.

با افزایش گلوتامات در فضای خارج سلولی، انفارکتوس رخ می دهد. سپس، با جابجایی آب، سلول‌ها متورم می‌شوند و در نتیجه ادم مغزی ایجاد می‌شود. نتیجه افزایش ++Ca داخل سلولی، تنظیم مثبت انواع سیستم های آنزیمی مانند لیپازها، پروتئازها و اندونوکلئازها است. در نتیجه، رادیکال‌های O2 آزاد از طریق مسیرهای بیوشیمیایی مختلف تولید می‌شوند و مرگ سلولی یا آپوپتوز رخ می‌دهد.

رادیکال های آزاد همچنین باعث ایجاد انواع واسطه های التهابی مانند سلکتین های پلاکت و اندوتلیوم، انواع مولکول ها و فاکتور های فعال کننده پلاکت، فاکتور نکروز تومور α و مجموعه ای از اینترلوکین ها می شوند. درک کامل این آبشارهای پاتوفیزیولوژیک پیچیده رویدادهای مولکولی و سلولی ناشی از ایسکمی بسیار مهم است زیرا یکی از اهداف استفاده از مدل‌های حیوانی ایسکمی مغزی جدا کردن این مکانیسم‌های مختلف آسیب برای رسیدن به یک مکان هدف بالقوه برای درمان ایسکمی است. مدل‌های ایسکمی مغزی را می‌توان در حیوانات کوچک و بزرگ (مانند موش، موش صحرایی، جربیل، خرگوش، گربه، سگ، خوک، گوسفند، و میمون) انجام داد.

استفاده از حیوانات آزمایشگاهی کوچک نظیر موش و رت هزینه بسیار کمتری برای تهیه، القای مدل ایسکمی و نگهداری برای مدت زمان طولانی دارد. حیوانات کوچک (به ویژه موش ها) از نظر ژنتیکی همگن هستند و تغییرات ژنتیکی را می توان نسبتاً آسان برای تولید مثل موش های مختلف تراریخته انجام داد.

مطالب مرتبط: اِدِم مغزی در موش و رت – تست اوانس بلو مغزی موش یا رت

مدل MCAO انسداد شریان مغزی میانی به وسیله ی فیلامان سیلیکونی

شریان مغزی میانی (MCA) و شاخه‌های آن عروق مغزی هستند که اغلب در سکته مغزی ایسکمیک انسان تحت تأثیر قرار می‌گیرند و تقریباً ۷۰ درصد از انفارکتوس‌ها را تشکیل می‌دهند. در بین مدل‌های سکته مغزی انسدادی MCAO، انسداد بخیه داخل شریانی MCA (MCAO) رایج‌ترین روش ایجاد مدل ایسکمی مغزی در جوندگان است. این مدل، کمتر تهاجمی است و نیازی به کرانیکتومی ندارد و بنابراین از آسیب به ساختارهای جمجمه جلوگیری می کند.

این تکنیک شامل انسداد موقت شریان کاروتید مشترک (CCA)، با وارد کردن فیلامان سیلیکونی به طور مستقیم به شریان کاروتید داخلی (ICA) و پیشبرد فیلامان تا زمانی که جریان خون به MCA را قطع کند است. متداول ترین مدت استفاده از فیلامان سیلیکونی ۶۰ دقیقه، ۹۰ دقیقه و ۱۲۰ دقیقه یا MCAO دائمی در موش صحرایی است. بسته به مدت زمان MCAO، این روش منجر به انفارکتوس ناحیه ای در موش ها می شود که شامل جسم مخطط و قشر پیشانی-پاریتال و گیجگاهی می شود، و همچنین باعث ایجاد انفارکتوس در تالاموس و هیپوتالاموس می شود.

مدل MCAO چندین مزیت دارد: اول اینکه، این مدل سکته مغزی ایسکمیک انسان را تقلید می کند، و یک نیم سایه شبیه به سکته مغزی انسان را نشان می دهد. علاوه بر این، مدل MCAO با حجم انفارکتوس بزرگ و تکرارپذیری بالا مشخص می شود. علاوه بر این، انجام این روش نسبتاً آسان است و زمان بر نیست.

مدل MCAO به وسیله ی کرانیکتومی

در این روش MCAO نیاز به جراحی مستقیم است که با کرانیکتومی و برش سخت شامه MCA نمایان می شود. دو روش برای القای این مدل وجود دارد. روش اول شامل جداسازی غده پاروتید و عضله تمپورالس، قطع قوس زیگوماتیک، و برداشتن جمجمه روی MCA است. در این روش MCA را می توان با جریان الکتریکی و ترانسکشن های اضافی به طور دائمی مسدود کرد یا به وسیله ی گیره، قلاب، لیگاتور یا روش فتو شیمیایی مدل MCAO را ایجاد کرد.

روش دوم القا مدل MCAO به وسیله ی کرانیکتومی مدل انسداد سه رگ است که شامل انسداد اضافی هر دو شریان CCA است که جریان خون جانبی را کاهش می‌دهد و در نتیجه آسیب ایسکمیک را تثبیت می‌کند.

اندازه انفارکتوس بسته به انسداد دائمی یا موقتی MCA و CCA متفاوت است. ایسکمی مغزی ناشی از این روش اکثر قشر پس سری پیشانی، جداری، گیجگاهی و ماده سفید زیرین و قسمت حاشیه ای جسم مخطط را در معرض خطر قرار می دهد. این تکنیک از آسیب تالاموس، هیپوتالاموس، هیپوکامپ و مغز میانی که در مدل MCAO  به واسطه ی فیلامان سیلیکونی دیده می شود جلوگیری می کند. در مقایسه با مدل MCAO به وسیله ی فیلامان سیلیکونی، این روش باعث ایجاد انفارکتوس کوچکتری می شود.

مطالب مرتبط: جراحی استریوتاکسی در حیوانات آزمایشگاهی – اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی نظیر موش، رت

مدل فتوترومبوز

مدل سکته مغزی فوتوترومبوتیک مبتنی بر فوتواکسیداسیون داخل عروقی است که منجر به ضایعات ایسکمیک کاملاً مشخص در قشر و جسم مخطط می شود. به صورت داخل وریدی (موش صحرایی)، و جمجمه دست نخورده در عرض چند دقیقه توسط یک پرتو نور در طول موج مشخصی تحت تابش قرار می گیرد. . این مدل بیشتر با پیشرفت سریع مرگ سلولی ایسکمیک مشخص می‌شود.

ناحیه تابش را می‌توان با استفاده از مختصات استریوتاکسی تعیین کرد که ایسکمی کانونی مغزی را القا می کند. مزایای دیگر مدل فتوترومبوتیک حداقل مداخله جراحی مورد نیاز، تکرارپذیری بالای ضایعه و مرگ و میر کم است. معایب این مدل به دلیل ماهیت انسداد شریان انتهایی آن است.

مدل اندوتلین-۱

مدل دیگری از سکته کانونی مبتنی بر کاربرد اندوتلین-۱ (ET-1) است. ET-1 یک پپتید قوی منقبض کننده ی عروق دیر اثر است. می توان آن را مستقیماً روی MCA در معرض قرار گرفته به عنوان تزریق داخل مغزی (استریوتاکسی) یا روی سطح قشر مغز اعمال کرد که منجر به یک ضایعه ایسکمیک وابسته به دوز با ادم ایسکمیک حاشیه ای می شود.

مزایای مدل ET-1 کمتر تهاجمی بودن، مرگ ‌و میر کم، و همچنین امکان القای ایسکمی کانونی مستقیم در نواحی عمقی و سطحی مغز است. با این حال، نشان داده شده است که ET-1 باعث آستروسیتوز می شود و جوانه زدن آکسون را تسهیل می کند، که ممکن است با تفسیر آزمایش های ترمیم عصبی تداخل داشته باشد.

تست های رفتاری و حسی حرکتی مدل ایسکمی مغزی

نمره عصبی

این مدل تست رفتاری در ابتدا برای امتیازدهی عصبی، برای ارزیابی نتیجه سکته مغزی در بیماران انسانی ایجاد شد. این روش جنبه‌های متعدد عملکردهای عصبی، از جمله هوشیاری، بینایی، عملکرد حرکتی، عملکرد حسی، پاسخ کلامی و رفلکس‌های ساقه مغز را ارزیابی می‌کند. که تست ها و استاندارهای مختلفی برای این امتیاز دهی وجود دارد که در ادامه به چند مورد از آن اشاره خواهد شد.

نمره بدرسون

نمره بدرسون، که می‌تواند روی موش‌ها اعمال شود، عملکرد عصبی کلی را ارزیابی می‌کند. امتیاز بدرسون، جوندگان را در مقیاس ۰-۳ درجه‌بندی می‌کند. در صورتی که حیوانات هر دو اندام جلویی خود را به سمت زمین دراز کنند، درجه ۰ (بدون نقص) تعلق می گیرد. درجه ۱ (نقایص خفیف) زمانی داده می شود که حیوانات خم شدن اندام جلویی را بدون هیچ گونه ناهنجاری دیگری نشان دهند. درجه ۲ (نقایص متوسط) زمانی داده می شود که حیوانات خم شدن اندام جلویی و کاهش مقاومت در برابر فشار جانبی به سمت پارتیک را نشان دهند. حیوانات بیشتر رفتار چرخشی را نشان می دهند درجه ۳ (نقایص شدید) را دریافت می کنند. برای انعکاس نقایص شدیدتر عصبی، سیستم نمره بدرسون برای ترکیب درجه ۴ و درجه ۵ اصلاح شده است. به طور خاص، حیوانات دارای چرخش طولی پس از سکته مغزی درجه ۴ و آنهایی که حرکت ندارند دارای درجه ۵ هستند.

امتیاز شدت عصبی mNSS

یکی دیگر از تست های عصبی پرکاربرد در جوندگان پس از سکته است. این ارزیابی های عصبی را در جنبه های مختلف، از جمله عملکرد حرکتی، عملکرد حسی و عملکرد رفلکس، با نمره کل ۱۴ نشان داده می شود. نمره ۱ تا ۴ نشان دهنده نقص خفیف است، ۹ نقایص متوسط ​​را نشان می دهد و نمره ۱۰ تا ۱۴ نشان دهنده نقص شدید است. mNSS برای ارزیابی پیامدهای طولانی مدت در مدل های مختلف سکته مغزی استفاده شده است. در یک مدل ایسکمی مغزی کانونی، موش‌های سکته مغزی در روزهای ۱ و ۲۸ پس از MCAO امتیاز mNSS بالاتری را نشان دادند، که نشان‌دهنده اختلال عصبی است.

مطالب مرتبط: انواع تست های رفتاری در موش و رت – القای مدل بیماری آلزایمر

تست گارسیا

برای ارزیابی نتیجه عملکردی MCAO، گارسیا یک مقیاس عصبی ایجاد کرد که عملکردهای حرکتی و حسی را در موش‌ها ارزیابی می‌کند. به طور خاص، حیوانات بر اساس فعالیت خود به خودی (۰-۳)، تقارن حرکت اندام (۰-۳)، دراز شدن اندام جلویی (۰-۳)، قدرت بالا رفتن و گرفتن (۰-۳)، تقارن حس عمقی بدن (۰-۳)، و عملکرد حسی (۰-۳) امتیاز می‌گیرند.. مقیاس گارسیا به عنوان مجموع نمره در هر آزمون نشان داده می شود. در این مقیاس، نمره کمتر نشان دهنده پیامد سکته مغزی شدیدتر است. گارسیا عمدتاً در سکته مغزی ایسکمیک استفاده می شود.

تست اپن فیلد

آزمون اپن فیلد یا تست میدان باز (Open Field) برای ارزیابی سطح فعالیت حرکتی عمومی و رفتار اکتشافی محیط برای حیوانات آزمایشگاهی بخصوص جوندگان استفاده می شود، این آزمون توانایی ارزیابی میزان اضطراب حیوان را نیز دارد. تست اپن فیلد همچنین قابلیت ارزیابی حافظه حیوان را به منظور شناسایی شی یا محرک دارد.

موش آزمایشگاهی در آزمون اپن فیلد قرار می گیرد و به مدت ۱۰ دقیقه اجازه کاوش می یابد. رفتار اکتشافی آن از طریق ویدئو ضبط و تجزیه و تحلیل می شود. توانایی حرکتی، هدف اصلی این آزمایش، با مسافتی که موش طی می کند آشکار می شود. فاصله بیشتر نشان دهنده توانایی حرکتی بالاتر است. با استفاده از سیستم آنالیز خودکار مانند نرم افزار ردیابی ویدیویی می توان مسیر حرکت موش را نیز تحلیل کرد. مجموع مسافت و مسیر رایج ترین پارامترهایی هستند که توسط سیستم آنالیز خودکار اندازه گیری می شوند. علاوه بر این، زمان بی حرکت و رفتار عقب نشینی نیز می توانند جمع آوری و تجزیه و تحلیل شوند تا امکان ارزیابی جامع توانایی حرکتی فراهم شود.

تست TTC مغزی

تست TTC مغزی برای تشخیص آسیب ایسکمیک در انواع بافت پستانداران استفاده می شود. این ماده به طور گسترده برای رنگ آمیزی بافت میوکارد انسان و حیوانات آزمایشگاهی و همچنین مدل های آنفارکتوس مغزی مورد استفاده قرار می گیرد زیرا استفاده از آن سریعتر و ارزان تر از هیستوپاتولوژی معمولی است.

مطالب مرتبط: القا مدل PCO –ایجاد مدل آزواسپرمی
خدمات مرتبط:  پژوهش و مطالعه بروی حیوانات آزمایشگاهی