مولکولی

تکنیک Multiplex PCR

نحوه انجام تکنیک PCR Multiplex

تکنیک Multiplex PCR چیست؟

Multiplex PCR تشخیص همزمان چندین توالی هدف با چند جفت پرایمر متفاوت (هر جفت برای هر هدف) را در یک واکنش منفرد فراهم می کند. با استفاده از تکنیک Multiplex PCR می توان در زمان و هزینه ها صرفه جویی نمود و احتمال ایجاد آلودگی را تا حد زیادی کم کرد.

پرایمر های مورد استفاده در واکنش Multiplex PCR باید با دقت انتخاب شوند تا دمای اتصال مشابهی داشته باشند و مکمل یکدیگر نباشند. اندازه های آمپلیکون باید به اندازه کافی متفاوت باشد تا باندهای متمایز در هنگام مشاهده بروی ژل الکتروفورز ایجاد شود.

واکنش های Multiplex PCR را می توان به طور کلی به دو دسته تقسیم کرد

  • واکنش Single Template PCR

این تکنیک از یک الگوی منفرد استفاده می کند که می تواند یک DNA ژنومی به همراه چندین جفت پرایمر باشد تا مناطق خاصی را در یک توالی الگو تکثیر کند.

  • واکنش Multiple Template PCR

از چندین توالی الگو و چندین مجموعه پرایمر در یک لوله واکنش استفاده می کند. وجود پرایمرهای متعدد ممکن است منجر به هیبریداسیون متقاطع با یکدیگر و احتمال اتصال اشتباه با سایر الگوها شود.

در Multiplex PCR تکثیر همزمان چندین توالی هدف ممکن است
در Multiplex PCR تکثیر همزمان چندین توالی هدف ممکن است

مطالب مرتبط: انواع واکنش زنجیره ای پلیمراز PCRتکنیک Nested PCR

طراحی پرایمر برای Multiplex PCR

طراحی پرایمر برای برخی از اهداف Multiplex می تواند پیچیده باشد. محصولات طولانی تر اغلب با کارایی کمتری سنتز و تکثیر می شوند. محققان از نرم افزار های طراحی پرایمر برای انتخاب هدف استفاده می کنند. تعدادی از این نرم افزار ها نظیر PrimerPlex به صورت رایگان در دسترس هستند.

PrimerPlex یک ابزار کارآمد برای طراحی پرایمر های خاص برای سنجش Multiplex PCR است.

این برنامه پرایمرها را برای واکنش متقابل بررسی و عدم تطابق Tm را به حداقل می رساند تا بهترین مجموعه مالتی پلکس ممکن را به شما ارائه دهد. در این فرآیند، میلیون ها مجموعه مالتی پلکس ممکن را در چند ثانیه تجزیه و تحلیل می کند و لیستی از مجموعه های جایگزین را ارائه می دهد.

نکات طراحی پرایمر برای Multiplex PCR

  • طول پرایمر

روش های Multiplex PCR شامل طراحی تعداد زیادی پرایمر است، بنابراین لازم است پرایمر طراحی شده دارای طول مناسب باشد. معمولا از پرایمرهایی با طول کوتاه در محدوده ۱۸ تا ۲۲ باز استفاده می شود.

  • دمای ذوب

پرایمرهایی با Tm مشابه، ترجیحاً بین ۵۵-۶۰ درجه سانتیگراد استفاده می شوند. برای توالی هایی با محتوای GC بالا، پرایمرهایی با Tm بالاتر (ترجیحاً ۷۵-۸۰ درجه سانتیگراد) توصیه می شود. تغییر Tm بین ۳-۵ درجه سانتیگراد برای پرایمرهای مورد استفاده قابل قبول است.

  • اختصاصیت

در نظر گرفتن اختصاصیت پرایمرهای طراحی شده برای توالی های هدف، در حین آماده سازی یک واکنش Multiplex، مهم است، به ویژه به دلیل رقابتی که برای اتصال به توالی های هدف متعدد که در یک ظرف واکنش وجود دارد.

  • اجتناب از تشکیل پرایمر دایمر

پرایمرهای طراحی شده باید از نظر تشکیل دایمرهای آغازگر، با وجود تمام پرایمرها در مخلوط واکنش بررسی شوند. دیمریزاسیون منجر به تکثیر غیر اختصاصی می شود.

پارامترهای دیگر مشابه دستورالعمل های استاندارد در طراحی پرایمر PCR هستند.

مطالب مرتبط: اصول طراحی پرایمرمبانی طراحی پرایمر miRNAآموزش طراحی پرایمر qPCR

همچنین تعیین مقادیر نسبی توالی ­های هدف برای به دست آوردن نتایج دقیق سودمند است. اگر یک هدف با فراوانی بسیار بیشتری از هدف دیگر باشد، آنگاه هدف فراوانتر ممکن است dNTP ها را مصرف و به طور فعالی با هدف با فراوانی کمتر رقابت کند. این محدودیت را می توان با محدود کردن غلظت پرایمر هدف بسیار فراوان که منجر به مصرف پرایمر ها رفع کرد. در نمونه‌ای با فراوانی ناشناخته، ممکن است لازم باشد پروتکل‌ها را با آزمایش غلظت‌های محدودکننده پرایمر برای هر هدف بهینه کنیم.

پرایمر های مورد استفاده در واکنش Multiplex PCR باید با دقت انتخاب شوند
پرایمر های مورد استفاده در واکنش Multiplex PCR باید با دقت انتخاب شوند

مزایای Multiplex PCR

  • استفاده از کنترل های داخلی در Multiplex PCR

مشکلات بالقوه در یک PCR ساده شامل منفی کاذب به دلیل شکست واکنش یا مثبت کاذب به دلیل آلودگی است. منفی های کاذب اغلب در سنجش های مولتی پلکس آشکار می شوند زیرا هر آمپلیکون یک کنترل داخلی برای سایر قطعات تکثیر شده فراهم می کند.

  • نشان دادن کیفیت الگو

کیفیت الگو ممکن است در Multiplex موثرتر از یک واکنش ساده PCR تعیین شود.

  • نشان دادن مقدار الگو

با استفاده از استانداردهای داخلی و تکثیر به صورت نمایی، Multiplex PCR را می توان برای ارزیابی مقدار یک الگوی خاص در یک نمونه استفاده کرد. برای اندازه‌گیری دقیق الگوها با استفاده از Multiplex PCR، مقدار الگوی مرجع، تعداد چرخه‌های واکنش و حداقل مهار دو برابر شدن نظری محصول برای هر چرخه باید در نظر گرفته شود.

  • اطلاعات بیشتر با نمونه کمتر
  • توان عملیاتی بالاتر
  • مقرون به صرفه بودن به واسطه مصرف dNTP، آنزیم ها و سایر مواد مصرفی کمتر
  • صرفه جویی در زمان
  • داده های بیشتر از مواد اولیه محدود
  • افزایش دقت نرمال سازی داده ها
  • خطاهای پیپتینگ کمتر

محدودیت های تکنیک Multiplex PCR

از محدودیت های تکنیک Multiplex PCR می توان به حجم کم نمونه اشاره کرد که تا همین اواخر، داشتن الگوهای کافی برای بهینه‌سازی می‌توانست برای نمونه‌هایی، با محدودیت در دسترسی، مشکل‌ساز باشد. با این حال، ظهور کیت های preamplification تا حد زیادی مشکل حجم نمونه محدود را کاهش داده است.

کاربرد تکنیک Multiplex PCR

در تحقیقات علوم زیستی، تشخیص بالینی و آزمایشگاه های پزشکی قانونی به وفور از این تکنیک استفاده می شود.

  • ژنوتایپیگ SNP ها
  • تشخیص پاتوژن ها
  • تشخیص GMO (ارگانیسم اصلاح شده ژنتیکی)
  • مطالعات پزشکی قانونی
  • تجزیه و تحلیل مواد غذایی
  • تجزیه و تحلیل جهش ها و پلی مورفیسم
  • تجزیه و تحلیل حذف ژن (به ویژه برای بیماری DMD و آزواسپرمی در مردان)
  • بررسی کمیت الگو
  • تشخیص RNA در نمونه های مختلف

 مطالب مرتبط: اصول واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) – روش های مختلف استخراج RNA از سلول و بافت
خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک PCR و Real time PCR

نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

11 − 4 =

همچنین ببینید
بستن
دکمه بازگشت به بالا