ارائه خدمات مولکولی با پیشرفته ترین دستگاه ها و مجرب ترین اساتید

فریزرهای با دمای منفی ۸۰ درجه سانتی گراد یک گزینه مناسب برای ذخیره سازی طولانی مدت مواد بیولوژیکی است. این دما از تجزیه اسیدهای نوکلئیک، پروتئین ها و بسیاری از مولکول های بیولوژیکی جلوگیری می کند. در مواردی که دمای منفی ۸۰ موجود نباشد و یا شرایط ارسال نمونه با یخ خشک میسر نیست، نمونه ها را می توان در محلول های نمک سولفات آبی غوطه ور نمود. مشابه تجاری و آماده این ترکیب با نام  RNALater  موجود می باشد که می توان بر روی بافت های جدا شده از جاندار و یا سلول اضافه نمود. بافت های جامد را می توان به مدت یک هفته در RNALater در دمای اتاق ذخیره کرد. برای نگهداری طولانی مدت لازم است نمونه های حاوی این محلول در منفی ۲۰ ذخیره گردد. برای جابجایی و انتقال نمونه های فریز شده، لازم است دمای منفی ۸۰ را با استفاده از یخ خشک صنعتی حفظ شده و به سرعت نمونه ها به آزمایشگاه مورد نظر انتقال داده شوند.

در بررسی متیلاسیون، اساس عملکرد تکنیک‌هایی که پایه‌ی آن‌ها تغییرات بیوشیمیایی توسط بی‌سولفیت است به این صورت می باشد که سیتوزین‌های غیرمتیله به یوراسیل تبدیل می‌شوند ولی بر روی سیتوزین‌های متیله عملکردی ندارند. بنابراین بی سولفیت بسته به حضور یا عدم حضور متیل روی سیتوزین تغییرات ویژه‌ای را در DNA ایجاد می‌کند که با روش‌های PCR، توالی‌یابی و MicroRNA قابل ارزیابی است. امروزه چندین روش برای بررسی آنالیز متیلاسیون DNA وجود دارد. با این حال، هیچ روش خاصی به عنوان تکنیک “اصلی” شناخته  نشده است. هر روش دارای مزایا و معایب است. روش‌هایی که در آن می‌توان از کیت‌های تجاری برای تشخیص متیلاسیون استفاده کرد به عنوان بهترین روش برای تیمار بیسولفیت شناخته می شوند.

بسته به  نوع تکنیک، کیفیت مورد نیاز برای RNA و DNA استخراج شده متفاوت است.  در انواع روش های توالی یابی مانند NGS به کیفیت بالایی از RNA نیاز است در صورتی که برای فرآیند ریل تایم پی سی آر نمونه با کیفیت متوسط هم کافی است. به همین منظور لازم است از کیفیت نمونه استخراج شده قبل از انجام کار مطلع شد. در بررسی اولیه نمونه استخراج شده نمونه را با استفاده ژل آگاروز ۱.۵% تفکیک می کنند. در یک نمونه با کیفیت از DNA باند مربوط به آن در بالای ژل مشاهده می شود. در نمونه های RNA، ۳ قطعه RNA , 18 S,28 S, 5.8 S به صورت ۳ باند جداگانه تفکیک می گردد. وجود اسمیر در ژل نشان از تخریب RNA می باشد. در یک روش دیگر برای تعیین دقیق کیفیت  RNAاستخراج شده از دستگاه Bioanalyzer استفاده می شود که با استفاده از آن عنوان عدد یکپارچگی RNA  (RIN Value) نمایش داده می شود. در نمونه های تخریب شدهRNA ، ارتفاع قله برای قله های rRNA 28S و 18S کاهش می یابد و در نمونه های با کیفیت، قله های به صورت تفکیک شده از هم مشاهده خواهد شد. هر چقدر عدد RNA به ۱۰ نزدیکتر باشد، آن نمونه از کیفیت بالاتری برخوردار است.

انتخاب روش PCR به طراحی مطالعه ارتباط دارد. به طور مثال برای بررسی بیان ژن در سطح  mRNAو non Coding RNA از روش هایPCR  کمّی و یا PCR کلاسیک می توان استفاده نمود. بررسی تغییرات ژنومی، جهش های ژنی و پلی مورفیسم از DNA استفاده می شود و انتخاب نوع PCR بسته به نوع نمونه، روش مطالعه و حساسیت مطالعه، اطلاعات موجود در بانک ژنی و… قابل تعیین است. از روش ARMS برای شناسایی جهش های نقطه ای استفاده می شود که در آن پرایمر بر اساس آلل های مختلف به صورت انحصاری طراحی می شود. از RFLP برای تشخیص انواع پلی مورفیسم، ژنوتایپ و غربالگری جهش های شناسایی شده استفاده می گردد که اساس آن بر تفاوت بین سایز قطعات در برش های آنزیمی محدودالاثر محصولات حاصل از PCR است. از روش Nested برای ردیابی توالی DNA هدف استفاده می گردد که در آن از دو جفت پرایمر تو در تو استفاده می شود. اختصاصیت این روش به دلیل نوع پرایمر بسیار بالا می باشد. علاوه بر این می توان از انواع pcr برای شناسایی انواع سویه های میکروبی، انگل و .. استفاده نمود به طور مثال multiplex pcr قابلیت شناسایی همزمان چند سویه باکتری و یا انگل را در یک واکنش دارد. در این تست از چندین جفت پرایمر اختصاصی به صورت همزمان استفاده می گردد.

نرم‌افزارهای متعددی همچون ,UCSC ,Primer3 ,MEDUSA,Oligo7 برای طراحی پرایمر وجود دارد که روند طراحی پرایمر را برای کاربر آسان نموده است. پرایمرها را باید پس از طراحی در نرم افزار آنلاین Primer3، در صفحه‌ی Primer BLAST موجود در سایت NCBI((http://www.ncbi.nlm..nih.gov/tools/primer-blast  بررسی نموده تا از عدم اتصال آن به سایر ژن‌ها مطمئن شویم. به طور کلی در طراحی پرایمرها باید نکات بسیار مهم و کاربردی زیر را رعایت کرد. – طول آن بین ۱۸ تا ۳۰ نوکلئوتید باشد، – بهتر است محتوایGC بین %۵۰ تا %۶۰ باشد ( افزایش مقدار محتوای GC منجربه افزایش درجه حرارت اتصال و متعاقب آن افزایش استحکام هیبرید و دایمر پرایمر خواهد شد) – عدم وجود تفاوت چشمگیر بین دمای اتصال دو پرایمر پیشرو و پسرو ( در شرایط مطلوب این اختلاف بین منفی ۵ و ۵ باشد) – عدم وجود نواحی مکمل در یک پرایمر و یا پرایمرهای مختلف به خصوص در انتهای ۳پرین (برای ایجاد اتصال محکم لازم است انتهای ۳ یکی از نوکلئوتیدهای G یاC باشد) – Tm پرایمرها ترجیحاً بین۶۰-۵۸ درجه سانتی‌گراد طراحی شود و حداکثر اختلاف بینTm دو پرایمر ۳ درجه باشد – طراحی پرایمر از نواحی پایدار (احتمال کمتر وقوع جهش) DNA هدف صورت گیرد – برای پیشگیری از تکثیر DNA ژنومی باید پرایمر‌ها طوری انتخاب شود که سر ۳پرین آن روی یک اگزون و سر ۵پرین آن روی اگزون دیگر باشد به این ترتیب چون تکثیر از cDNA انجام می‌شود که فاقد اینترون است،DNA ژنومی تکثیر نخواهد شد.

یکی از اشتباهات رایج بین دانشجویان ، به کار بردن واژه RT-PCR برای سه تست کاملا متفاوت ,cDNA Synthesis     Real Time PCR  , RT-PCR   است. در صورتی که این سه تست دارای تفاوت های بسیاری هستند.  اصطلاح RT-PCR  برای هر سه مورد سنتزcDNA  qPCR, و یا pcr  کلاسیک استفاده می شود. در سنتز cDNA از RNA به عنوان الگو استفاده می شود که آنزیم رونوشت بردار معکوس در یک چرخه دمایی با استفاده از توالی پرایمر(الیگو dt و یا رندوم هگزامر)  از روی DNA می سازد. در صورتی که  درPCR کلاسیک و qPCR ازcDNA به عنوان الگو استفاده شده  و در چندین سیکل دمایی از روی یک ژن با  پرایمر اختصاصی تکثیر خواهد شد.  تفاوت این دو PCR  در این است که در qPCR از ترموسایکلر ویژه استفاده می شود که می تواند سیگنال فلورسنت بازتاب شده را تشخیص داده و  در نهایت نتایج را به صورت کمّی گزارش کند. اما در PCR کلاسیک نتایج به صورت نیمه کمّی گزارش می شود که در آن محصولات  PCR پس از تفکیک در ژل الکتروفورز با نرم افزار اختصاصی به صورت کمّی قابل گزارش است.