آماده سازی لام از بافت ها

مطالعه بافت برای قرن ها به منظور شناسایی و مشاهده ساختار طبیعی بافت انجام شده است. با این حال، دلایل مختلفی وجود دارد که ممکن است بافت را از ساختار اصلی خود تغییر دهد. چندین فرآیند از قبیل: فیکس، پروسس، آغشتگی، برش و رنگ آمیزی وجود دارند که باعث می شود بافت ها از طریق میکروسکوپ بهتر قابل مشاهده و تشخیص باشند. در مطالعه بافت شناسی، آماده سازی بافت برای مشاهده میکروسکوپی یک نکته مهم است.

بافت ها، مجموعه هایی از سلول ها هستند که عملکردهای خاص و یکسانی را در بدن انجام می دهند و نقش مهمی در زندگی روزمره دارند. با این حال به سختی قابل تشخیص و تفکیک هستند، زیرا بیشتر آن ها به صورت ترکیبی بی رنگ به نظر می رسند. روش های کاملی وجود دارند که مشاهده بافت را آسان تر می کند.

مراحل آماده سازی لام از بافت

فیکس کردن (Fixation)

جهت آماده سازی لام از بافت ها فیکس کردن به عنوان اولین گام برای حفظ بستر بافت می باشد. این مرحله باید در اسرع وقت انجام شود زیرا اکثر سلول ها حاوی لیزوزوم هستند که پس از مرگ سلول ها، هضم سلولی را انجام داده و آنزیم های هضم کننده را آزاد می کنند تا اجزای سلول را تجزیه کنند. علاوه بر این، میکروارگانیسم های خارج سلولی، غالباً باکتری ها، از فرصت استفاده کرده و سلول های مرده را از طریق پوسیدگی برای جذب مواد مغذی تجزیه می کنند. با فیکس شدن، می توان هضم سلولی و پوسیدگی را متوقف و بسترهای بافت را حفظ کرد.

مطالب پیشنهادی: آماده سازی بافت در آزمایشگاه بافت شناسی – مراحل پرفیوژن و فیکس کردن بافت در بدن حیوانات آزمایشگاهی

در فرایند فیکس شدن این نکات باید رعایت شود

• بسترهای بافت را جمع، متورم و یا سفت نکنید.
• اجزای بافت را حل نکنید
• شکل اصلی ترکیبات بافت را در طول فرآیند بعدی بافت حفظ کنید.
• میزان نفوذ باید کافی باشد.

در این مرحله ، از فرمالین ۱۰٪  که ماده ثابت کننده شیمیایی است به دلیل ضریب نفوذ بالا،ارزان بودن و حفظ بهتر اندامک های سلولی استفاده می شود. فقط باید توجه نمود که فرمالین قابل اشتعال است و باید در هنگام استفاده از آن دقت نمود.

پروسس بافتی (Processing)

پس از مرحله فیکس شدن، بافت ها به اندازه کافی محکم و منسجم نیستند تا بتوان بخش های نازک را برش زد به همین دلیل باید مرحله پروسس انجام شود. قبل از پروسس، بافت ها را درون کاست های مورد نظر قرار می دهند و کاست ها را شماره گذاری می کنند.  

مرحله آبگیری بافت ها

به منظور از بین بردن تمام آب موجود در بستر بافت انجام می شود. در این مرحله آب موجود در بافت ها باید به طور کامل حذف شود در غیر این صورت در نفوذ پارافین خلل ایجاد می شود. اتانول در فرآیند آبگیری مورد استفاده قرار می گیرد زیرا در مقایسه با سایرعوامل، آبگیری کمترین عوارض جانبی را روی لایه های بافتی دارد.

پارافین در اتانول نامحلول است. به این منظور ماده ای که هم در اتانول و هم درپارافین قابل حل شدن است، مورد نیاز می باشد. از آنجا که زایلن کمترین تأثیر را روی لایه های بافت دارد، در آزمایش از این ماده استفاده می شود. با این حال، زایلن می تواند بافت را سخت کند ، بنابراین زمان بودن بافت ها در زایلن نباید طولانی شود. پس از این مرحله، بافت با پارافین نفوذپذیر می شود.

مراحل انجام مرحله آبگیری

• اتانول  %۷۰: برای یک ساعت
• اتانول  %۷۰: برای یک ساعت
• اتانول  %۹۵: برای یک ساعت
• اتانول  %۱۰۰: برای یک ساعت. این مرحله ۴ بار تکرار می شود.
• زایلن ۱: برای یک ساعت
• زایلن ۲: برای یک ساعت
• پارافین ۱: برای ۲ ساعت
• پارافین ۲: برای ۳ ساعت

قالب گیری (Embedding) پارافینی

قبل از برش، بافت هایی که پروسس شدند باید به فرم “بلوک” درپارافین قرار گیرند تا قابل برش شوند.

مراحل قالب گیری

• کمی پارافین را در قالب های بافت ریخته و اجازه داده می شود تا پارافین در لایه زیرین قالب ها تشکیل شود.
• بافت ها با پنس بر روی مرکز قالب قرار داده می شوند.
• کاست های پلاستیکی را بر روی قالب قرار داده و در صورت لزوم پارافین بیشتری به قالب اضافه می شود.
• سپس قالب ها به منظور خنک سازی سریع، به صفحه سرد منتقل می شود.

برش گیری (Cutting)

از دستگاه میکروتوم برای برش مقاطع استفاده می شود. حمام آب باید در دمای حدود ۴۵ تا ۵۰ درجه سانتی گراد تنظیم شود. مقدار کمی الکل یا مواد شوینده باید در حمام آب اضافه شود تا کشش سطحی کاهش یابد و اجازه دهید برش ها به راحتی صاف شوند. تاشدگی در مقاطع را می توان با پنس از بین برد.

باید حدود ۳۰ ثانیه اجازه داده شود تا مقاطع برش داده شده در سطح آب شناور بمانند اگر این زمان بیشتر شود باعث انبساط بیش از حد و تخریب بافت می شود. سپس مقاطع باید با دقت و طوری بر روی لام قرار گیرند که هیچ حباب آبی در قسمت های زیرین به دام نیفتند. پس از برش هر بلوک، سطح آب را بهتر است جهت از بین بردن بقایای قبلی تمیز نمود. این کار را می توان با کشیدن دستمال کاغذی روی سطح آب انجام داد.

رنگ آمیزی (Staining)

در نهایت رنگ آمیزی با توجه به هدف پژوهش و نوع بافت انجام می شود.

مطلب پیشنهادی: انواع رنگ آمیزی های بافت شناسی – آنتی ژن رتریوال در تکنیک ایمونوهیستوشیمی

مشکلات احتمالی آماده سازی لام از بافت ها

دقت در مرحله فیکس کردن تاثیر زیادی در نتیجه کار دارد. نمونه ها باید قبل از پروسس برای تعیین اینکه آیا نیاز به فیکس شدن بیشتری دارند، بررسی شوند. همچنین در استفاده از آنتی بادی های مورد نظر باید دقت نمود و مشخصات آنتی بادی ها را با دقت مطالعه کرد. همچنین مراحل شستشو باید با دقت انجام شود.

اگر بافت ها در هنگام قرار گرفتن در پارافین دچار نرم شدگی شوند ممکن است به این دلیل باشد که معرف ها در مرحله پروسس با آب اشباع شده اند در این صورت باید معرف ها را تغییر داده و بافت را دوباره پردازش کرد یکی دیگر از دلایل می تواند اشباع پارافین با زایلن یا ایزوپروپانول باشد در این صورت پارافین را تغییر داده و بافت را دوباره پردازش می کنیم.

اگر بافت ها در طی انجام برش با میکروتوم از بلوک های پارافینی خارج شوند ممکن است به دلیل وجود آب در بافت، درست انجام نشدن مرحله آبگیری و نفوذ پارافینی ضعیف باشد در  این صورت بهتر است معرف ها را تغییر و پروسس مجدد بافت را با پروتکل مناسب تغییر دهید. همچنین در مراحل رنگ آمیزی باید توجه کرد که رنگ آمیزی به طور بهینه انجام شود.

به عنوان مثال اگر رنگ آمیزی مقاطع بافتی ناقص باشد معمولاً به دلیل وجود مقدار ناکافی از رنگ در ظرف رنگ آمیزی است. برای جلوگیری از این مشکل، ظرف را تا قسمت مناسب جهت رنگ آمیزی درست از محلول رنگ آمیزی مورد نظر پر کنید. درست انجام شدن تمام این مراحل باعث تضمین نتیجه می شود.

برای مشاهده سایر مطالب بافت شناسی اینجا کلیک کنید

در صورتی که نیاز به مشاوره تخصصی در زمینه آماده سازی بافت دارید اینجا کلیک کنید.

منابع

Bancroft, J. D., & Gamble, M. (2002). Theory & practice of histological technique (5th ed.). N.Y: Churdchill Livingstone.
Davenport, H. W. (1997). Physiology of gastrointestinal tract (2nd ed.). N.Y: Raven Press.
Eroschenko, V. P. (2008). Atlas of histology with functional Correlation (11th ed.). London: Lippincott Williams & Wilkins.
Kiernan, J. A. (2008). Histological & Histochemical methods (4th ed.). Sydney: Scion Publisihng Ltd.

مطالب مرتبط: تکنیک ایمونوهیستوشیمی IHC – تست تانل – تکنیک ایمونوسیتوشیمی
خدمات مرتبط: بافت‌ شناسی، مهندسی بافت و رنگ آمیزی های پاتولوژی