استخراج DNA از سلول و بافت

استخراج DNA و RNA اولین مرحله مورد نیاز در زیست شناسی مولکولی از جمله تشخیص بسیاری از بیماری ها در پزشکی و بررسی شواهد در جرم شناسی، مهندسی ژنتیک در حیوانات و گیاهان است. استخراج DNA برای اولین بار در سال ۱۸۶۹ انجام شد.

مراحل اصلی استخراج DNA عبارتند از

• لیز سلولی که با افزودن محلول حاوی مواد دترجنت

• غیر فعال سازی DNAse ها و RNAse ها، با استفاده از حلال های آلی

• خالص سازی DNA و حذف RNA، لیپیدها و پروتئین ها

• رقیق سازی DNA استخراج شده

ترکیبات DNA در همه گونه ها کم و بیش یکسان است، ترکیباتی مانند RNA و پروتئین ها و مقادیر نسبی آنها به طور قابل توجهی متفاوت است که این تغییرات باید در هنگام انتخاب روش لیز سلولی در نظر گرفته شود. پروتکل های مختلفی برای استخراج اسید های نوکلئیک وجود دارد. این روش‌ها از پروتکل‌های دستی بسیار ابتدایی تا روش‌های پیچیده‌تر موجود در پروتکل‌های استخراج DNA خودکار متفاوت هستند.

یکی از روش های رایج برای استخراج DNA استفاده از مواد دترجنت (شوینده) و آنزیم ها برای حل شدن و لیز غشای سلولی است. شوینده های رایج مورد استفاده SDS، Triton X-100 و CTAB هستند. به منظور لیز بهتر دیواره سلولی، برخی آنزیم هایی که به اجزای سطح سلول یا سیتوزول حمله می کنند اغلب به بافرهای لیز مبتنی بر شوینده ترکیب می شوند.

نقطه ضعف لیز سلولی مبتنی بر دترجنت ها این است که مواد شوینده اغلب نمونه های DNA را آلوده کرده و نتایج مراحل بعد را تحت تاثیر قرار می دهد زیرا انجام هر فرآیند مولکولی، نیازمند DNA با کمیت و کیفیت بالا می باشد. بنابراین، انتخاب یک روش استخراج مناسب ضروری است و هنگام ارزیابی گزینه های موجود باید چندین نکته را در نظر گرفت.

انواع روش‌ها و تکنیک های استخراج DNA

انواع روش‌های استخراج DNA با هدف دستیابی به تجذیه مؤثر در سلول‌ها، دناتوره کردن کمپلکس‌های نوکلئوپروتئین، غیرفعال‌سازی نوکلئازها و سایر آنزیم‌ها، حذف آلاینده‌های بیولوژیکی و شیمیایی و در نهایت رسوب DNA پیروی می‌کنند.

پروتئیناز K یک آنزیم رایج مورد استفاده در پروتکل های مختلف برای جدا کردن گلیکوپروتئین ها و غیر فعال کردن RNAse ها و DNAse ها است.

فنل یک اسید کربولیک است که به سرعت پروتئین ها را دناتوره می کند، اما بسیار خورنده، سمی و قابل اشتعال است. این حلال آلی معمولاً به نمونه اضافه می شود و سپس با استفاده از نیروی گریز از مرکز، امولسیون دو فازی به دست می آید. لایه آبدوست بالایی حاوی DNA رقیق شده است و لایه آبگریز پایینی از حلال های آلی، پروتئین ها و سایر ترکیبات آبگریز تشکیل شده است.

مطلب پیشنهادی: متیلاسیون DNA و بررسی طول تلومر

مخلوطی از DNA و غلظت های بالای نمک ها (مانند استات سدیم) در حضور حلال هایی مانند اتانول (با غلظت ۷۰٪ – ۸۰٪) یا ایزوپروپانول (غلظت نهایی ۴۰٪ – ۵۰٪) در نسبت های ۲:۱ یا ۱:۱ باعث رسوب اسیدهای نوکلئیک می شود. پس از رسوب DNA، مرحله شستشو با اتانول ۷۰ درصد برای حذف نمک اضافی از DNA انجام می پذیرد.

در نهایت، اسیدهای نوکلئیک در آب عاری از نوکلئاز (nuclease free) یا بافر TE (10 میلی‌مولار تریس، ۱ میلی‌مولار (EDTA رقیق می‌شوند. بافر TE معمولاً برای ذخیره‌سازی طولانی‌ مدت DNA استفاده می‌شود، زیرا از آسیب دیدن آن توسط نوکلئازها جلوگیری می‌کند. تریس PH ایمن برای نگهداری DNA را فراهم کرده و EDTA یون های دو ظرفیتی مورد استفاده در فعالیت هسته را مسدود و با آسیب اکسیداتیو ناشی از فلزات سنگین مقابله می کند.

اساس روش های استخراج DNA

انواع روش های استخراج DNA به طور کلی بر دو اساس مبنی بر حلال (Solution based) و مبنی بر فاز جامد ( Solid phase) طراحی شده اند.

استخراج DNA مبتنی بر حلال با استفاده از نمک زدایی (Salting Out)

در سال ۱۹۸۸، میلر و همکارانش پروتکلی را منتشر کردند که به خالص سازی DNA از طریق رسوب پروتئین در غلظت های نمک بالا منجر شد. پروتکل سنتی شامل لیز اولیه سلولی و هضم با SDS-پروتئیناز K، و به دنبال آن افزودن غلظت‌های بالایی از نمک‌ها، معمولاً ۶ مولار کلرید سدیم است. سپس مخلوط سانتریفیوژ می‌شود تا پروتئین‌ها رسوب کند و مایع رویی حاوی DNA است که سپس به یک ویال جدید منتقل می‌شود. سپس DNA با استفاده از اتانول یا ایزوپروپانول به همان روشی که برای روش‌های حلال آلی توضیح داده شد، رسوب می‌کند.

از مزایای استخراج DNA به روش Salting Out نسبت به روش فنل-کلروفرم، استفاده معرف‌ های غیرسمی، مقرون به صرفه‌ تر و همچنین استخراج DNA با کیفیت بالاتر انجام می شود.

روش های استخراج DNA فاز جامد

این تکنیک با استفاده از ذرات نامحلول بر پایه سیلیس، که از نظر شیمیایی شبیه به فنل بوده، که با پروتئین‌ها برهمکنش داده و امکان خالص‌سازی DNA را فراهم می‌کنند، انجام می شود. تعدادی از روش‌های مختلف با استفاده از روش استخراج DNA مایع/جامد در اکثر کیت‌های استخراج تجاری موجود، استفاده می‌شوند.

تکنیک های بر این پایه، DNA را تحت شرایط pH خاص و محتوای نمک از طریق یکی از اصول زیر جذب می کنند:

• اتصال هیدروژن در حضور یک عامل آشوبگر(chaotropic agent) به یک ماتریکس آبدوست
• تبادل یونی با استفاده از مبدل آنیون در شرایط آبی
• مکانیسم های affinity and size exclusion

اکثر تکنیک های فاز جامد از یک ستون اسپین برای اتصال اسید نوکلئیک تحت نیروی گریز از مرکز استفاده می کنند. ستون‌های اسپین از ماتریس‌های سیلیکا، ذرات شیشه‌ای یا حامل‌های تبادل آنیونی ساخته می‌شوند و این ترکیبات عموماً باید با استفاده از محلول‌های بافر در pH خاصی آماده شوند تا به فرم شیمیایی مورد نیاز تبدیل شوند. سلول‌هایی که قبلاً با استفاده از بافرهای لیز تجزیه شده‌اند، روی ستون‌ها اعمال شده ، سانتریفیوژ می‌شوند و DNA به کمک شرایط pH و غلظت نمک ایجاد شده توسط محلول‌های اتصال، به ستون متصل می‌شود. برخی از پروتئین ها و سایر ترکیبات بیوشیمیایی نیز ممکن است به ستون متصل شوند و بعداً با استفاده از بافرهای شستشو طی یک سری مراحل شستشو حذف می شوند. DNA در نهایت در آب مقطر استریل یا بافر TE شسته می شود.

روش استخراج DNA با استفاده از ماتریس سیلیس و سیلیکایی

ماتریس های سیلیکایی خواص منحصر به فردی برای اتصال به DNA دارند. آنها دارای بار مثبت بوده که تمایل زیادی به بار منفی ستون DNA دارند. شرایط نمکی بالا و pH مناسب با استفاده از کاتیون‌های سدیم به دست می‌آید که محکم به اکسیژن با بار منفی در ستون فسفات DNA متصل می‌شوند. آلاینده ها با یک سری مراحل شستشو حذف شده و به دنبال آن رقیق سازی DNA با استفاده از بافر TE یا آب مقطر استریل انجام می شود.

در این پروتکل ها، نمونه های خون برای چند دقیقه با بافر لیزکننده انکوبه می شوند. زمان تقریبی پروتکل حدود ۴۰ دقیقه تا ۱ ساعت طول می کشد و بازده بالایی از DNA با حداقل آلودگی را تولید می کند.

به علت استفاده از ستون‌های سیلیکا در این کیت، سرعت استخراج افزایش یافته و استفاده آن برای افراد کم تجربه بسیار راحت خواهد بود. همچنین در این روش به میزان کمی از بافت اولیه نیاز است. این کیت علاوه بر نمونه‌های آزمایشگاهی مناسب نمونه‌های بیمارستانی تحقیقاتی می‌باشد، زیرا مراحل انجام پروسه کوتاه و غیروابسته به سمپلینگ کاربر خواهد بود. منتهی در این روش میزان هزینه بالاتر از روش های غیر ستونی است.

استخراج DNA با استفاده از رزین های تبادل آنیونی

مواد شیمیایی با بار مثبت که قادر به اتصال به اسیدهای نوکلئیک با بار منفی یا آلاینده ها یا آنزیم هایی مانند نوکلئازها هستند، رزین های تبادل آنیون نامیده می شوند و همچنین به عنوان بخشی از پروتکل های استخراج DNA از نمونه های خون استفاده می شوند.

رزین، از کوپلیمرهای استایرن دی وینیل بنزن ساخته شده است که حاوی یون های ایمنودی استات جفتی است. در پروتکل‌های استخراج DNA به‌ عنوان رزین تبادل یونی که به یون‌های فلزی چند ظرفیتی مانند نوکلئازها متصل می‌شود، استفاده می‌شود.

روش های استخراج DNA با استفاده از دانه های مغناطیسی (magnetic beads)

ذرات مغناطیسی از یک یا چند هسته مغناطیسی ساخته شده‌اند که با ماتریکسی از پلیمرها، سیلیس یا هیدروکسی آپاتیت با گروه‌های عاملی نهایی پوشانده شده‌اند.

به طور مثال: ۳۰ میکرولیتر خون کامل با حجم مساوی از محلول ۱% SDS مخلوط می شود. لوله دو یا سه بار با وارونگی مخلوط شده و به مدت ۱ دقیقه در دمای اتاق انکوبه می شود. ۱۰ میکرولیتر نانوذرات مغناطیسی به این مخلوط اضافه می شود و به دنبال آن، ۷۵ میکرولیتر بافر اتصال (۱.۲۵ مولار کلرید سدیم و ۱۰ درصد پلی اتیلن گلیکول ۶۰۰۰) اضافه می شود.

محلول با وارونگی مخلوط می شود و به مدت ۳ دقیقه در دمای اتاق انکوبه شده و گلوله مغناطیسی با استفاده از آهنربای خارجی برای دور ریختن مایع رویی رسوب می کند. پلت مغناطیسی با اتانول ۷۰ درصد شسته شده و خشک می شود. گلوله مغناطیسی در ۵۰ میکرولیتر از بافر TE معلق می شود و ذرات مغناطیسی متصل به DNA با انکوباسیون در دمای ۶۵ درجه سانتیگراد با هم زدن مداوم شسته می شوند.

از ویژگی های متمایز این روش می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:

• اتصال اختصاصی DNA به دانه‌های مغناطیسی سبب کاهش آلودگی، خلوص بیشتر و کیفیت بهتر محصول می‌گردد و قابل استفاده به روش‌های استخراج دستی و اتوماتیک می باشند. همچنین میزان مواد مصرفی، نیروی کار و زمان نیز کاهش می‌یابد.

انتخاب پروتکل مناسب

پروتکل مناسب بسته به تجهیزات تخصصی باید از نظر معیار حساس، سریع، آسان، بدون آلودگی متقاطع احتمالی نمونه ها و حداقل خطر برای کاربران باشد. در نهایت، و مهمتر از همه، روش استخراج DNA انتخاب شده باید بتواند نمونه های DNA خالص با کمیت بالا را برای استفاده در کاربردهای مولکولی استخراج کند.

روش استخراج ایده آل باید دارای مشخصه هایی از جمله حساسیت بالا، سازگار، سریع و آسان برای استفاده باشد و بسته به تجهیزات تخصصی یا دانش بیوشیمیایی مهم باشد. همچنین باید حداقل خطر را برای کاربران به همراه داشته باشد و همچنین از آلودگی متقاطع احتمالی نمونه ها جلوگیری شود.

بررسی کیفیت DNA استخراج شده

کیفیت و کمیت DNA ژنومی استخراج ‌شده از نمونه‌های خون یکی از ویژگی‌های کلیدی است که باید هنگام انتخاب پروتکل به آن توجه شود.

در ابتدا کیفیت نمونه های DNA را با ژل آگارز ۱% کنترل می کنیم تا از سلامت نمونه و باند بدون اسمیر اطمینان حاصل شود. زیرا حضور اسمیر نشان دهنده تجذیه شدن DNA می باشد.

مطلب پیشنهادی: نحوه انجام تکنیک ژل الکتروفورز – روش های مختلف استخراج RNA از سلول و بافت

غلظت نمونه DNA به ازای ۲۰۰ میکرولیتر خون باید در محدوده ۵۰-۵ میکروگرم بسته به نوع نمونه و تعداد سلول ها باشد. چگالی نوری یا OD روشی است که برای تخمین مقدار DNA موجود در محلول با اندازه‌گیری جذب در ۲۶۰ نانومتر استفاده می‌شود.

همچنین اندازه گیری جذب نور فرابنفش با استفاده از اسپکتروفتومتری یا دستگاه نانودراپ در طول موج های مختلف (۲۳۰ نانومتر، ۲۶۰ نانومتر و ۲۸۰ نانومتر) یک راه سریع و کارآمد اولیه برای تعیین خلوص و غلظت نمونه های اسید نوکلئیک است. خلوص نمونه های اسید نوکلئیک در نسبت جذب A260/A280 ارزیابی می شود و مقادیر در محدوده ۱.۷-۲.۰ به طور کلی قابل قبول در نظر گرفته می شوند. از آنجایی که RNA خالص دارای نسبت A260/A280 2.0 است، نمونه DNA با نسبت A260/A280 بیشتر از ۱.۸ نشان دهنده آلودگی RNA است. نسبت جذب ۲۶۰/۲۳۰ بین ۲.۰ و ۲.۲ نیز به عنوان معیار ثانویه خلوص DNA در نظر گرفته می شود.

مطالب مرتبط: نسل جدید توالی یابی (NGS) و کاربرد های آن – تکنیک Multiplex PCR
خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک PCR و Real time PCR