تکنیک ARMS-PCR

تکنیک ARMS-PCR چیست؟

تکنیک Amplification Refractory Mutation System PCR (ARMS-PCR) یا Allele-specific PCR براساس جفت شدن بازی دقیق بین انتهای ۳^‘ پرایمر و الگو است و نتیجه آن تکثیر تنها یک آلل خاص می باشد.

از ARMS-PCR برای تعیین ژنوتایپ SNP (پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی) با کمک پرایمرهای مقاوم استفاده می‌شود. طراحی پرایمر برای آلل های جهش یافته (با SNP) و نرمال (بدون SNP) امکان تکثیر انتخابی را فراهم می کند که به راحتی پس از الکتروفورز قابل تجزیه و تحلیل است.

اصلاح یک باز منفرد در انتهای ۳^‘ پرایمر رخ می دهد به طوری که یک پرایمر با آلل طبیعی و دیگری با آلل جهش یافته مطابقت دارد. هر دو نوع پرایمر طی دو واکنش متوالی PCR (روش دو لوله ­ای) یا در یک مخلوط واکنش PCR ترکیب می شوند تا PCR به طور همزمان انجام شود. تکثیر یک نوع آللی به توانایی پرایمرها برای اتصال و وجود آلل نرمال یا جهش یافته بستگی دارد.

مطالب مرتبط: انواع واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR – تکنیک Nested PCR

اصلاح پرایمرها مهمترین نکته در مکانیسم ARMS-PCR است. تکثیر انتخابی به دلیل عدم تطابق ایجاد شده برای انواع پرایمر اتفاق می افتد. ایجاد عدم تطابق در انتهای ۳^‘ پرایمر، دمای اتصال به نقطه هدف (Annealing) را برای نوع آللی تغییر می‌دهد. از آنجایی که Taq DNA پلیمراز قادر به انجام فعالیت اگزونوکلئاز نیست، در صورت عدم تطابق سنتز رخ نمی دهد. روش کلی ARMS-PCR شامل چهار مرحله اصلی است که شامل طراحی پرایمر، سنتز، الکتروفورز و آنالیز نتایج می باشد.

طراحی پرایمر ARMS-PCR

برای طراحی پرایمر، اگر توالی DNA ما، برای مثال، دارای یک G در آلل طبیعی و A به جای G، در آلل جهش یافته باشد. طراحی یک پرایمر forward برای آلل طبیعی باید حاوی C باشد در حالی که آلل جهش یافته حاوی T در انتهای ۳′ باشد. موفقیت ARMS-PCR به وجود یک باز دارای عدم تطابق اضافه در نزدیکی SNP در انتهای ۳^‘ بستگی دارد.

جفت‌های ناهماهنگ قوی شامل C: T، G: A و A: G هستند که فرآیند تکثیر را تا ۱۰۰ برابر کاهش می‌دهند. پرایمر Reverse به طور کلی ثابت می ماند. علاوه بر این، پرایمر ها همچنان باید تمام معیارهای پرایمر ایده آل مانند PCR معمولی را داشته باشد.

مطالب مرتبط: اصول طراحی پرایمر – مبانی طراحی پرایمر miRNA – آموزش طراحی پرایمر qPCR

ARMS-PCR سیکل های PCR کمتری نسبت به واکنش معمولی دارد که به جای ۳۵ تا ۴۰ ، شامل ۲۲ تا ۲۵ سیکل است. بالا بردن سیکل های PCR احتمال نتایج مثبت کاذب را افزایش می دهد. از این رو، در ARMS-PCR، داشتن کنترل داخلی که با کاهش احتمال نتایج مثبت کاذب دقت بیشتری را فراهم می کند.

پس از تکثیر، قطعات تکثیر شده مستقیماً بر روی ژل آگارز ۲ درصد قرار می گیرند تا بدون نیاز به هیبریداسیون، نتایج حاصل شود. نمونه ها به صورت متوالی بارگذاری می شوند و به مدت ۴۵ دقیقه Run می شوند. هنگام تفسیر نتایج، وجود نوارهای کنترل داخلی در تمام چاهک ها نشان می دهد که واکنش هیچ نتیجه مثبت کاذبی ندارد. باید تفاوت های آشکاری در الگوهای نواری در آلل های نرمال و جهش یافته وجود داشته باشد.

کاربرد تکنیک ARMS-PCR

این تکنیک که یکی از دقیق ترین ابزارها در تشخیص بیماری های ژنتیکی است، یک روش استاندارد مرجع برای هموگلوبینوپاتی ها، تالاسمی و کم خونی داسی شکل است. علاوه بر این، در تشخیص جهش JAK2 و HIV نیز قابل استفاده است. ARMS-PCR می تواند برای تعیین SNP ها برای تشخیص جهش در پانل های مختلف بیماری استفاده شود.

مزایای تکنیک ARMS-PCR

• شناسایی جهش­ های نقطه­ ای (SNP)
• تعیین ژنوتیپ در تشخیص بیماری ­ها (هتروزیگوت ناقل)
• سرعت، دقت و اعتبار بالا

محدودیت هایتکنیک ARMS-PCR

• عدم تشخیص حذف، مضاعف شدگی­ ها و ناهنجاری های کروموزومی
• SNP هایی که قبلاً گزارش شده اند آنهایی هستند که فقط توسط ARMS-PCR شناسایی می شوند.
• وجود نتایج منفی کاذب در صورت عدم وجود کنترل داخلی در PCR یا زمانی که نوسان دما در طول چرخه PCR وجود داشته باشد.
•  در نهایت، هزاران SNP را نمی توان در یک Run شناسایی کرد.

 مطالب مرتبط: اصول واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) – روش های مختلف استخراج RNA از سلول و بافت
خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک PCR و Real time PCR